牛晓辉 教授 主任医师、博士生导师 北京积水潭医院骨肿瘤科主任 中国临床肿瘤学会（CSCO）肉瘤专家委员会主任委员 中国抗癌协会（CACA）肉瘤专业委员会前任主任委员 国际保肢协会（ISOLS）中国区唯一BOARD MEMBER 中国临床肿瘤学会（CSCO）理事 中国抗癌学会（CACA）理事 《中国骨与关节杂志》副总编辑 亚太骨与软组织肿瘤学会 (APMSTS) 常务理事 东亚骨与软组织肿瘤协作组 (EAMOG) 前主席、常务理事 中华医学会骨科分会骨肿瘤专业组副组长 中国医师协会骨科分会骨肿瘤专业组副组长 北京医学会骨科分会骨肿瘤学组组长 主持制定《CSCO经典型骨肉瘤诊疗指南》、《CSCO软组织肉瘤诊疗指南》、《CSCO骨巨细胞瘤诊疗指南》等 地舒单抗（Denosumab）是首个RANKL（receptor activator of NF-κB ligand，核因子-κB受体激活剂配体）抑制剂，全球获批用于治疗不可手术切除或手术切除可能导致严重功能障碍的骨巨细胞瘤，以及预防多发性骨髓瘤患者和实体肿瘤骨转移患者的骨骼相关事件，和双膦酸盐难治性恶性肿瘤高钙血症的治疗。作为目前市面上唯一的骨靶向药物，地舒单抗是如何一步步从实验室走向临床应用的呢？今天就和大家一起来聊聊地舒单抗的研发历程。 安进公司（Amgen Inc.）早在90年代利用DNA测序发现了一种蛋白，这种蛋白可以保护骨骼免受破骨细胞对骨质的溶解，因此将它取名为“骨保护素”（osteoprotegerin，OPG）。随后，科学家继续通过重组融合的技术筛选出了可以与OPG结合的配体，也就是OPGL（OPG Ligand）。研究人员并没有就此而止，他们紧接着又发现了一种与TNF（Tumor Necrosis Factor，肿瘤坏死因子）相关的细胞因子，也就是现在的RANKL（receptor activator of NF-κB ligand，核因子-κB受体激活剂配体）。顾名思义，RANKL的受体叫做RANK，RANK（核因子-κB受体激活剂）最初是在DC细胞（树突状细胞）中鉴定出来的，而它同样表达于破骨细胞和破骨细胞的前体上。更加巧合的是，RANKL的序列和OPGL序列是相同的，这也就意味着，OPG可以诱捕性地与RANKL结合，OPG、RANKL和RANK就这样紧密联系在了一起。 了解了OPG、RANKL和RANK这三个概念后，我们再来看一下这三者构成的信号通路，这个信号通路在调控破骨细胞的形成及其在骨重建中发挥着重要作用。RANKL是以膜结合形式和可溶形式存在的，在基质细胞和成骨细胞或骨细胞的细胞膜上表达，二者都有促进破骨细胞分化的生物活性。每一个RANKL三聚体可以结合最多3分子的RANK，当与具有RANK的细胞表面的RANK结合时，可使破骨细胞及其前体上的受体聚集。在足够多的RANK聚集之后，量变引起质变，这个通路的信号就会被激活，通过TNFR（肿瘤坏死因子受体）相关因子，尤其是TRAF6（TNF receptor associated factor 6）来启动传导，最终使破骨细胞发挥骨吸收的活性。OPG是一种可溶性分泌蛋白，天然的OPG在成熟的B细胞以及巨噬细胞中表达，正因为可以与RANKL结合，所以被称作RANKL的分泌性诱骗受体，也是生理性的RANKL抑制剂（下图）。它的作用是参与调控正常的骨代谢。 虽然了解到了破骨细胞被激活的通道，但是科学家的探索精神永远不会停止，他们在临床前研究模型探索了大量的OPG变体，包括OPG单体形式——聚乙二醇–OPG单体，以及RANK与抗体Fc段融合的RANK-Fc，但这些仅仅停留在了临床前阶段。到了临床研究阶段，重组OPG的改进版本是将OPG活性区与Fc段的C-端结合构成，这也是在人体试验的第一种OPG（Fc-OPG）。另一种糖基化后的OPG-Fc（AMG-0007），是将OPG活性区与Fc段的N-端结合，其半衰期相比较Fc-OPG延长了大约十倍，效力提高了三到十倍。但考虑到个体人群中对OPG免疫反应的诱导可能会带来潜在的安全风险，安进最终停止了OPG-Fc的开发，转向了抗RANKL的制备方法。（下图） 讲到这里，主角终于准备登场了。随着抗体治疗技术的重大进步，转基因小鼠提供了可以快速生成并且亲和力高的全人源化的单克隆抗体，而选用IgG2的抗体亚型是由于这种抗体几乎没有对表达RANKL的细胞有害的分子效应（例如ADCC和CDC，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用和补体依赖的细胞毒作用）。另一方面，天然的IgG2抗体的铰链区二硫键不同于IgG1和IgG4，非常容易受到木瓜蛋白酶作用而被水解失去效能，而安进拥有成熟的改造IgG2抗体的专利技术，即对铰链区进行修饰，改造后的IgG2抗体减少了异构体的差别，并且对木瓜蛋白酶的抵抗作用增强，药代动力学特征也更适合成药。在此技术基础上，全新的人源化单克隆抗体——地舒单抗诞生了。 地舒单抗具有与重组OPG-Fc相似的分子量，都可与可溶性或膜结合的人RANKL结合，但地舒单抗比人OPG-Fc更具特异性，同时地舒单抗明显延长了半衰期。自此，地舒单抗作为哺乳动物和人类中活性最高的RANKL抑制剂开始了后续临床开发的征程。回到刚开始的问题，为什么说地舒单抗是唯一的骨靶向药物呢？这还是要从药物的作用机制来看，目前市面上主流的骨改良药物——双膦酸盐是与骨盐紧密结合后，通过抑制甲羟戊酸途径引起破骨细胞的凋亡来减少骨吸收作用。而地舒单抗作为首个获批的特异性靶向RANKL的单克隆抗体，通过阻止RANKL活化破骨细胞及其前体表面的RANK，抑制破骨细胞的活化与成熟，以此达到减少骨吸收的作用。虽然这两类药物都仅对骨有亲和性，但是严格来说，根据精准治疗的定义地舒单抗有真正、明确的靶点，更符合骨靶向药物的定义。 以上就是地舒单抗临床前的设计过程，理解了OPG–RANK–RANKL信号通路、以及RANKL抑制剂的制备过程，有助于广大医务工作者充分了解地舒单抗，从而更好地在临床实践中应用地舒单抗，以服务更多的骨病患者。 参考文献： 1.David L. Bench to bedside: elucidation of the OPG–RANK–RANKL pathway and the development of Denosumab. Nat Rev Drug Discov. 2012 May;11(5):401-19. 2.Simonet, W. S. et al. Osteoprotegerin: a novel secRETed protein involved in the regulation of bone density. Cell 89, 309–319 (1997). 3.Martin, T. J. Paracrine regulation of osteoclast formation and activity: milestones in discovery.J. Musculoskelet. Neuronal Interact. 4, 243–253 (2004). 4.Lacey, D. L. et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell 93, 165–176 (1998). 5.Wong, B. R. et al. TRANCE is a novel ligand of the tumor necrosis factor receptor family that activates c?Jun N?terminal kinase in T cells. J. Biol. Chem. 272,25190–25194 (1997). 6.The American Society for Bone and Mineral Research President’s Committee on Nomenclature. Proposed standard nomenclature for new tumor necrosis factor family members involved in the regulation of bone resorption. J. Bone Miner. Res. 15, 2293–2296(2000). 7.Body, J. et al. A Phase I study of AMGN?0007, a recombinant osteoprotegerin construct, in patients with multiple myeloma or breast carcinoma related bone metastases. Cancer 97, 887–892 (2003).
OPG和 RANKL及其受体的发现
OPG–RANK–RANKL信号通路
RANKL抑制剂的开发
全人源RANKL抗体的开发
地舒单抗的生物学特性和药理作用
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