长期在肿瘤科工作的医师会发现 ALK 融合突变漏诊率比较高，对于小于 40 岁、不吸烟、伴有胸腔积液的晚期 NSCLC 患者，如果基因检测未检测到有价值的基因突变，有经验的临床医师会考虑换检测公司或检测方法着重对 ALK 融合基因进行 2 次检测。今天我们就看看这个 ALK 基因检测为什么这么令人头疼。9Oq帝国网站管理系统
首先，我们再复习一下什么是 ALK 基因融合突变。
肺癌中 ALK 基因突变类型为 ALK 融合突变或者称为 ALK 重排，这种突变模式与我们常见的基因点突变模式不同，比如常见的 EML4-ALK 融合突变，EML4 和 ALK 基因分别在 2 号染色体 DNA 的 p21 和 p23，两个基因相隔约 10MB 距离，这 2 个基因片段通过倒位融合形成新的融合基因 EML4-ALK。
与 EGFR 点突变模式相比，基因融合突变模式更为复杂，ALK 融合突变需要知道其断裂点（一般为 20 外显子，一般报告会写：ALK: intron20），需要确定其融合伴侣（EML4、TFG、KLC1、SOCS5、H1P1、TPR、BIRC6），虽然绝大部分融合伴侣为 EML4，但 EML4 也有很多亚型，截至目前，已经发现了 15 种以上的 EML-ALK 融合变体亚型。
而且 ALK 基因自己还存在点突变，部分点突变可导致 ALK 靶向药物耐药。综上多方面因素导致 ALK 基因检测复杂性。
RT-PCR 方法用于 ALK 基因检测争议很大，虽然国内 NMPA（中国药品监督管理局）已经批准了 RT-PCR 方法用于 ALK 基因检测，但该方法未被美国 FDA 和欧洲 EMA 批准，NCCN 指南对 RT-PCR 用于 ALK 检测也不十分认可（Targeted real-time PCR assays are used in some settings, although it is unlikely to detect fusions with novel partners.）。
在上文我们已经探讨了 ALK 融合类型多样性问题，和 NCCN 指出的问题一样，RT-PCR 最大的问题就不能检测所有的 ALK 融合类型，只能覆盖常见融合类型。也就是说对于不常见的 ALK 融合类型，RT-PCR 有可能出现漏检。
而且由于此方法需高纯度的 mRNA，因此对样本质量要求极高，对于新鲜标本的检测，其阳性率较高，但是临床上多数组织标本都用甲醛溶液固定，蜡块包埋，RNA 大量降解而使其灵敏度降低。RT-PCR 技术对实验室要求高，所以总体上 RT-PCR 并不是 ALK 融合基因检测常规方法。
FISH 因其对 ALK 融合基因检测敏感度和特异性均相对较高，被称为 ALK 融合基因检测的金标准。但 FISH 检测方法也有自身的问题，FISH 检测主要问题是对技术要求很高。
FISH 检测过程中，标本固定时间过长、烤片温度过高、蛋白消化不当、变性温度差异、都会使荧光信号减弱或无信号。而在 FISH 结果信号判读时对诊断医师要求很高，对于一些阈值附近的病例和不典型信号病例的错误判读容易造成结果假阴性或假阳性。
Ventana?D5F3 IHC-ALK 检测优先应用推荐
ALK 基因检测免疫组化方法分为: 非 Ventana?D5F3 抗体 IHC 和 Ventana?D5F3 IHC。
非 Ventana?D5F3 抗体检测未被 NMPA 批准，只能用于初筛，不能用于确诊。Ventana?D5F3 IHC 已被 FDA 和 NMPA 批准用于 ALK 基因检测，并且可以通过此方法确诊 ALK 融合突变。
Ventana?D5F3 IHC 法快速、经济、操作简单，且具有较高的灵敏度（100%）及特异性（98%），对样本需求量较低等一系列优点，该方法已经被 ALK 检测共识推荐优先应用。该方法最大缺点依然是对结果判读方面存在一些陷阱，容易造成假阳性或假阴性。
这几年 NGS（二代测序）在 ALK 基因检测中地位越来越高，NGS 检测分为 NGS-DNA 和 NGS-RNA。现在我们现在对于 ALK 的 NGS 检测绝大部分是 NGS-DNA，对于融合突变或跳跃突变实际上 NGS-DNA 准确率不是很好（假阴性发生率较高），NGS-RNA 才是检测融合或跳跃突变的更好的办法。
NGS-RNA 对检测的组织样本质量要求很高，而且并不能使用血液样本，这又限制了 NGS-RNA 的应用。
NGS 优点是能区分 ALK 突变所有的亚型和 ALK 基因本身可能存在的点突变，这样有助于我们发现 ALK-TKI 耐药的原因，以指导后续用药。NGS 的缺点还有检测费用非常贵，总体上 NGS 方法更推荐用于 ALK-TKI 耐药的患者。
注释：FFPE：福尔马林固定石蜡包埋；FISH：荧光原位杂交；IHC：免疫组化；NGS：二代测序；RT：逆转录
